Διερεύνηση του βακτηριακού πληθυσμού του δωδεκαδακτύλου και της παρουσίας βακτηρίων στη χολή σε γάτες με χρόνια φλεγμονώδη νόσο του εντέρου, χολαγγειίτιδα, παγκρεατίτιδα, τριαδίτιδα και λέμφωμα του λεπτού εντέρου, σε σύγκριση με υγιείς γάτες

 

> Περίληψη

Η αιτιοπαθογενετική σχέση της χλωρίδας του εντέρου και της παρουσίας βακτηρίων στη χολή στα γαστρεντερικά νοσήματα της γάτας δεν έχει διερευνηθεί. Σκοπός της μελέτης ήταν η βακτηριολογική ανάλυση του οπού δωδεκαδακτύλου και της χολής σε γάτες με χρόνια φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (ΦΝΕ), χολαγγειίτιδα, παγκρεατίτιδα και συνδυασμό αυτών (τριαδίτιδα), καθώς και σε γάτες με εντερικό λέμφωμα. Στην προοπτική αυτή μελέτη εντάχθηκαν σαράντα εννέα ασθενείς γάτες, 45 γάτες (25 συμπτωματικές, 20 ασυμπτωματικές) με ιστολογικά ευρήματα ΦΝΕ, ή/και χολαγγειίτιδας, ή/και παγκρεατίτιδας, 4 γάτες με εντερικό λέμφωμα, καθώς και 8 φυσιολογικές γάτες. Δείγματα οπού δωδεκαδακτύλου και χολής συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια ερευνητικής λαπαροτομής. Σ’αυτά έγινε καλλιέργεια υπό αερόβιες, αναερόβιες και μικροαερόφιλες συνθήκες για την απομόνωση, καταμέτρηση και ταυτοποίηση βακτηρίων, ακολουθώντας κλασικές μικροβιολογικές μεθόδους. Η σύγκριση του βακτηριακού πληθυσμού του δωδεκαδακτύλου μεταξύ των ομάδων των υπό διερεύνηση γατών ως προς την ανάπτυξη αερόβιων (P=0,831), αναερόβιων (P=0,406) και του συνολικού πληθυσμού βακτηρίων (P=0,752) δεν ανέδειξε στατιστικώς σημαντικές διαφορές. Στατιστικώς σημαντική διαφορά σημειώθηκε στις γάτες με τριαδίτιδα ως προς την ανάπτυξη των αναερόβιων Clostridium spp. (P=0,055). Τα δείγματα χολής των φυσιολογικών και το πλείστον (48/49, 98%) των ασθενών γατών ήταν αρνητικά στην ανάπτυξη βακτηρίων. Ωστόσο, σε ένα δείγμα χολής γάτας με ΦΝΕ και παγκρεατίτιδα παρατηρήθηκε ανάπτυξη στελέχους Enterobacter cloacae. Οι φλεγμονώδεις νόσοι του λεπτού εντέρου, του ήπατος και του παγκρέατος δε συνδέονται με ανάπτυξη βακτηρίων στη χολή. Η πιθανότητα η τριαδίτιδα να σχετίζεται με υπερανάπτυξη αναερόβιων βακτηρίων της εντερικής χλωρίδας, όπως των Clostridium spp., απαιτεί περαιτέρω έρευνα με χρήση ευαίσθητων μοριακών τεχνικών για να επιβεβαιωθεί.

> Εισαγωγή

Η εντερική χλωρίδα του σκύλου και της γάτας αποτελείται από μερικές εκατοντάδες έως χιλιάδες είδη αερόβιων, μικροαερόφιλων και υποχρεωτικά αναερόβιων βακτηρίων, με σύνθεση ιδιαίτερη και χαρακτηριστική του κάθε ζώου και διαφορές ακόμα και μεταξύ των ατόμων του ίδιου είδους. Ωστόσο, η βασική της σύνθεση δεν είναι πλήρως γνωστή.¹ Σύμφωνα με έρευνες που στηρίζονται στην καλλιέργεια,^2,3,4 τα κυριότερα είδη βακτηρίων που επικρατούν στο λεπτό έντερο της γάτας είναι η Escherichia coli και είδη των γενών Bacteroides, Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus και Clostridium, σε ποσοστά που ποικίλλουν κατά μήκος του γαστρεντερικού σωλήνα πλησιάζοντας προς το παχύ έντερο. Στο στομάχι έχουν αναφερθεί πληθυσμοί από 10¹ έως 10⁶ cfu/g, ενώ στο δωδεκαδάκτυλο και τη νήστιδα πληθυσμοί βακτηρίων από 10⁵ έως και 10⁹ cfu/ml σε ορισμένες γάτες. Ο αριθμός και η ποικιλότητα των ειδών των βακτηρίων αυξάνονται στον ειλεό (10⁷ cfu/ml) και ακόμα περισσότερο στο κόλον (>10⁹ cfu/ml).^2,14 Αερόβια είδη ανιχνεύονται σε μεγαλύτερα ποσοστά στα πρόσθια τμήματα του εντερικού σωλήνα, ενώ αναερόβια είδη επικρατούν στο κόλον. Στη γάτα, ωστόσο, ο αριθμός των αναερόβιων βακτηρίων που αποικίζουν το λεπτό έντερο φαίνεται να είναι μεγαλύτερος σε σχέση με αυτόν του σκύλου.^2,4,5

Τα τελευταία χρόνια αποδεικνύεται ότι, όπως στον άνθρωπο, έτσι και στο σκύλο και τη γάτα, αλλαγές στη σύνθεση της χλωρίδας του εντέρου εμπλέκονται σε χρόνιες εντεροπάθειες.^6-13 Υψηλότερες του φυσιολογικού συγκεντρώσεις εντερικών βακτηρίων στο εγγύς τμήμα του λεπτού εντέρου χαρακτηρίζουν το σύνδρομο της εντερικής βακτηριακής υπερανάπτυξης, το οποίο ενοχοποιείται για την εμφάνιση χρόνιων γαστρεντερικών συμπτωμάτων. Η βασική μέθοδος διάγνωσης είναι η καλλιέργεια υπό αερόβιες και αναερόβιες συνθήκες του εντερικού περιεχομένου που συλλέγεται από τον αυλό του δωδεκαδακτύλου.^14,15 Θεωρείται ως υπερανάπτυξη των βακτηρίων στο εγγύς τμήμα του λεπτού εντέρου στη γάτα η αύξησή τους σε πληθυσμούς άνω των 1,1x10⁹ cfu/ml εντερικού περιεχομένου.^4,14,15 Στις υγιείς γάτες ο συνολικός αριθμός των βακτηρίων στο εγγύς τμήμα του λεπτού εντέρου εμφανίζει μεγάλες διακυμάνσεις και συχνά ξεπερνά τα μεγέθη που αρχικά ορίστηκαν ως βακτηριακή υπερανάπτυξη. Επιπρόσθετα, εκτός από τις μεταβολές στον αριθμό των βακτηρίων μεγάλη σημασία έχει και η μεταβολή των ειδών των βακτηρίων που απαρτίζουν την χλωρίδα του εντέρου, διαταραχή που περιγράφεται με τον όρο «εντερική δυσβίωση» (intestinal dysbiosis).^5,15

Οι μεταβολές στη σύνθεση της χλωρίδας στο εγγύς τμήμα του λεπτού εντέρου, όπως και η παρουσία βακτηρίων στη χολή και η αιτιοπαθογενετική σχέση αυτών στα φλεγμονώδη νοσήματα του γαστρεντερικού της γάτας παραμένει αδιευκρίνιστη. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση του βακτηριακού πληθυσμού στο δωδεκαδάκτυλο και της παρουσίας βακτηρίων στη χολή σε γάτες που εμφάνιζαν ΦΝΕ, χολαγγειίτιδα, παγκρεατίτιδα ή συνδυασμό αυτών, συμπεριλαμβανομένης της νοσολογικής οντότητας της τριαδίτιδας (ΦΝΕ, χολαγγειίτιδα και παγκρεατίτιδα), ή εμφάνιζαν εντερικό λέμφωμα και αξιολόγηση σε σύγκριση με φυσιολογικές γάτες. Η παρούσα μελέτη αποτελεί συνέχεια προηγηθείσας μελέτης της κλινικο-εργαστηριακής και ιστοπαθολογικής εικόνας του συμπλέγματος της τριαδίτιδας της γάτας,¹⁶ στα πλαίσια της διερεύνησης της αιτιοπαθογένειας των φλεγμονωδών νοσημάτων του γαστρεντερικού.

> Υλικά και Μέθοδοι

- Σχεδιασμός της μελέτης

Στην προοπτική αυτή μελέτη περιλήφθηκαν γάτες οι οποίες προσκομίστηκαν από τους ιδιοκτήτες τους και εξετάστηκαν στην Μονάδα Παθολογίας, της Κλινικής των Ζώων Συντροφιάς, του Τμήματος Κτηνιατρικής, του Α.Π.Θ. (Φεβρουάριος 2008-Φεβρουάριος 2011). Το ερευνητικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από το Τμήμα Κτηνιατρικής (Έγκριση κλινικής έρευνας: Συνεδρίαση της Γ.Σ.Ε.Σ. του Τμήματος Κτηνιατρικής αριθ. 430/20-11-2007) και από αρμόδιο κρατικό φορέα (Έγκριση κλινικής έρευνας: Διεύθυνση Κτηνιατρική Θεσσαλονίκης, αρ. πρωτ. 13/3657/29.03.2010). Καμία ενέργεια δεν πραγματοποιήθηκε στις γάτες χωρίς την έγγραφη συγκατάθεση των ιδιοκτητών τους. Για τους σκοπούς της μελέτης εξετάστηκαν δυο κατηγορίες γατών: γάτες συμπτωματικές, οι οποίες προσκομίστηκαν στην Κλινική Ζώων Συντροφιάς με χρόνια συμπτωματολογία η οποία θα μπορούσε να παραπέμπει σε φλεγμονώδη νοσήματα του γαστρεντερικού, συμπεριλαμβανομένης της τριαδίτιδας ή εντερικό λέμφωμα (συγκεκριμένα παρουσίαζαν σταθερά ή με διαλείπουσα συχνότητα ένα ή συνδυασμό των παρακάτω συμπτωμάτων: μείωση της διάθεσης, αύξηση ή μείωση της όρεξης, έμετος, διαταραχή της σύστασης των κοπράνων, ίκτερος, απώλεια σωματικού βάρους), καθώς και ασυμπτωματικές γάτες που προσκομίστηκαν με σκοπό την ωοθηκεστερεκτομή τους. Τουλάχιστον 2 εβδομάδες πριν από τη διερεύνησή τους, όλες οι κλινικά υγιείς γάτες εισάγονταν σε ξεχωριστή πτέρυγα του Νοσηλευτηρίου της Μονάδας Παθολογίας της Κλινικής των Ζώων Συντροφιάς με σκοπό την προσαρμογή τους στο χώρο, την αποκλειστική διατροφή τους με βιομηχανοποιημένη ξηρά τροφή υψηλής ποιότητας (βασική σύνθεση: 33,8- 34,2% πρωτεΐνη, 21,9-22,3% λίπος, 36,9-38,1% υδρογονάνθρακες, 1,1-1,3%, ίνες και 0,80-0,88% ασβέστιο σε ξηρή ουσία) (Feline Adult Optimal Care™ Chicken- Dry, Science Plan™, Hill’s™) την παρακολούθησή τους και τη διενέργεια εργαστηριακών εξετάσεων.

Η επιλογή των γατών της μελέτης έγινε με βάση τα παρακάτω κριτήρια ένταξης: (1) ηλικία άνω του έτους και των δύο φύλων που ανήκαν σε διάφορες φυλές, (2) διατροφή με βιομηχανοποιημένη τροφή για γάτες (ξηρά ή/και κονσερβοποιημένη) τουλάχιστον για τις τελευταίες 8 εβδομάδες πριν την αρχική εξέταση, (3) έγγραφη συναίνεση των ιδιοκτητών για την διενέργεια ερευνητικής λαπαροτομής, βιοψίας και τη λήψη βιολογικών υλικών, (4) ιστοπαθολογικά ευρήματα φλεγμονής (εντερίτιδας, χολαγγειίτιδας, παγκρεατίτιδας ή συνδυασμών αυτών) ή εντερικού λεμφώματος με ή χωρίς την ταυτόχρονη παρουσία συμπτωμάτων την στιγμή της εξέτασης (ομάδα προς διερεύνηση) ή την διαπίστωση φυσιολογικών ιστοπαθολογικών και κλινικών ευρημάτων (ομάδα φυσιολογικών μαρτύρων).

Τα κριτήρια αποκλεισμού των γατών από την μελέτη ήταν τα παρακάτω: (1) παρουσία κλινικών ή εργαστηριακών ευρημάτων άλλων νοσολογικών καταστάσεων, που θα μπορούσαν να επηρεάσουν το ήπαρ, το πάγκρεας ή το λεπτό έντερο, (2) διαπίστωση άλλων ιστοπαθολογικών ευρημάτων πέραν των καθορισμένων του ήπατος, του παγκρέατος και του λεπτού εντέρου υπό διερεύνηση για το σκοπό της μελέτης, (3) θετικά αποτελέσματα παρασιτολογικής εξέτασης κοπράνων, (4) θετικά αποτελέσματα ορολογικών εξετάσεων ανίχνευσης αντισωμάτων κατά του ιού της ανοσοανεπάρκειας της γάτας (FIV), αντιγόνου του ιού της λευχαιμίας της γάτας (FeLV) και αντισωμάτων κατά του κορωναιού (FCoV) και της λοιμώδους περιτονίτιδας της γάτας (FIP), (5) παθολογικά αποτελέσματα της συγκέντρωσης της ολικής ή της ελεύθερης θυροξίνης στον ορό αίματος (T4, Free T4), (6) λήψη φαρμακευτικών ουσιών, όπως αντιμικροβιακών, αντιφλεγμονωδών ή ανοσοκατασταλτικών, τουλάχιστον για το διάστημα των δύο τελευταίων εβδομάδων πριν από την εξέταση.

Συμπτωματικές γάτες: Κατά τη διάρκεια της μελέτης, εξετάστηκαν 302 γάτες με κλινικά συμπτώματα, από τις οποίες 82 πληρούσαν τα κλινικά κριτήρια ένταξης, Με βάση τη συγκατάθεση των ιδιοκτητών για τη διενέργεια βιοψιών, 39 γάτες διερευνήθηκαν πλήρως, από τις οποίες 25 γάτες εντάχθηκαν στη μελέτη με βάση τα καθορισμένα κριτήρια.

Ασυμπτωματικές γάτες: Κατά την ίδια περίοδο, 39 γάτες χωρίς κλινικά συμπτώματα διερευνήθηκαν πλήρως, ακολουθώντας το ίδιο διαγνωστικό πρωτόκολλο με τις συμπτωματικές γάτες. Μετά την ολοκλήρωση της ιστοπαθολογικής εξέτασης, 11 γάτες αποκλείστηκαν λόγω των καθορισμένων κριτηρίων, 8 βρέθηκαν φυσιολογικές, ενώ σε 20 γάτες αποκαλύφθηκαν ιστοπαθολογικά ευρήματα φλεγμονής στα υπό εξέταση όργανα.

Μετά την ολοκλήρωση των ιστοπαθολογικών εξετάσεων όλες οι γάτες με ευρήματα φλεγμονής στο έντερο, το ήπαρ, το πάγκρεας, ανεξάρτητα με την παρουσία ή την απουσία συμπτωμάτων τη στιγμή της δειγματοληψίας, καθώς και οι γάτες με λέμφωμα του λεπτού εντέρου συμπεριλήφθηκαν στην ομάδα των γατών με παθολογικά ευρήματα προς διερεύνηση. Οι ασυμπτωματικές γάτες, με φυσιολογικά ευρήματα στις ιστοπαθολογικές εξετάσεις του ήπατος, του παγκρέατος και του εντέρου αποτέλεσαν την ομάδα των φυσιολογικών μαρτύρων.

Έτσι, στην έρευνά μας συμπεριλήφθηκαν συνολικά 57 γάτες: 49 γάτες με παθολογικά ευρήματα (45 γάτες με ιστοπαθολογικά ευρήματα διάφορων συνδυασμών ΦΝΕ, χολαγγειίτιδας, παγκρεατίτιδας, 4 με εντερικό λέμφωμα) και 8 φυσιολογικοί μάρτυρες.

- Ομάδες των γατών της έρευνας

Με κριτήριο τα αποτελέσματα της ιστοπαθολογικής εξέτασης, οι γάτες της έρευνας χωρίστηκαν σε 8 ομάδες, οι οποίες παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Σε μία γάτα με χολαγγειίτιδα, μία γάτα με ΦΝΕ και χολαγγειίτιδα, δυο γάτες με συνύπαρξη ΦΝΕ, χολαγγειίτιδας και παγκρεατίτιδας, δυο γάτες με ΦΝΕ και παγκρεατίτιδα, τρεις γάτες με ΦΝΕ και σε μία γάτα με λέμφωμα δεν λήφθηκε οπός δωδ/λου για ανάλυση.

Μ: μάρτυρες Χ: γάτες με ευρήματα χολαγγειίτιδας ΦΝΕ: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου ΦΝΕ+Χ: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου και χολαγγειίτιδας ΦΝΕ+Χ+Π: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου, χολαγγειίτιδας και παγκρεατίτιδας Π: γάτες με ευρήματα παγκρεατίτιδας ΦΝΕ+Π: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου και παγκρεατίτιδας Λ: γάτες με ευρήματα εντερικού λεμφώματος

 

- Ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ομάδων

ΦΝΕ: Συνολικά, τριάντα οκτώ γάτες εμφάνιζαν ευρήματα λεμφοκυτταρικού/πλασμοκυτταρικού τύπου ΦΝΕ. Στο σύνολο αυτών παρατηρήθηκε διήθηση από λεμφοκύτταρα, πλασμοκύτταρα και μακρο- φάγα στο βλεννογόνο του εντέρου, ενώ κάποια ουδετερόφιλα παρατηρήθηκαν σε ποικίλους αριθμούς και σπανιότερα, περιστασιακά εωσινόφιλα. Οι διηθήσεις, σε συνδυασμό με αρχιτεκτονικές βλάβες στο επιθήλιο του εντέρου, εκτείνονταν σε όλο το μήκος του (δωδεκαδάκτυλο, νήστιδα, ειλεό) με ποικίλη ένταση.

Χολαγγειίτιδα: Είκοσι εννέα γάτες εμφάνιζαν ιστοπαθολογικά ευρήματα χολαγγειίτιδας. Οι αλλοιώσεις χαρακτηρίζονταν στην πλειοψηφία τους από διήθηση των πυλαίων διαστημάτων από λεμφοκύτταρα κατά κύριο λόγο και σε πολύ μικρότερο βαθμό από πλασμοκύτταρα, ίνωση και υπερπλασία των χοληφόρων πόρων (λεμφοκυτταρικού τύπου χολαγγειίτιδα). Σε μικρό αριθμό γατών (5/29), παρατηρήθηκε παράλληλα παρουσία και ουδετερόφιλων κυττάρων (χρόνια ουδετεροφιλική χολαγγειίτιδα).

Παγκρεατίτιδα: Έντεκα γάτες εμφάνιζαν αλλοιώσεις χρόνιας παγκρεατίτιδας, με διήθηση από μονοκύτταρα και ίνωση. Σε πέντε από αυτές, παρατηρήθηκε παράλληλα και σημαντικός αριθμός ουδετερόφιλων κυττάρων (οι τρεις περιπτώσεις χαρακτηρίστηκαν ως χρόνια ενεργός παγκρεατίτιδα και οι δυο, όπου παρατηρήθηκαν και νεκρωτικές εστίες, ως οξεία νεκρωτική παγκρεατίτιδα σε συνδυασμό με χρόνια).

Λέμφωμα: Τέσσερις γάτες εμφάνιζαν αλλοιώσεις συμβατές με εντερικό λέμφωμα. Χαρακτηρίζονταν από διάχυτη συνάθροιση μονομορφικού πληθυσμού λεμφοκυττάρων στο χόριο του βλεννογόνου και στον υποβλεννογόνιο χιτώνα με πολυεστιακές διηθήσεις στις μυϊκές στιβάδες, ενώ σε κάποιες περιπτώσεις και ενδοεπιθηλιακά. Δεν παρατηρήθηκαν, παρά ελάχιστα, από τους άλλους τύπους φλεγμονικών κυττάρων, ενώ παρατηρήθηκαν μικρο-διαβρώσεις και διαβρώσεις του επιθηλίου της επιφάνειας. Σε μια γάτα παρατηρήθηκε αυξημένος αριθμός λεμφοκυττάρων στο χόριο.

- Κλινική και Διαγνωστικές εξετάσεις

Στο σύνολο των 57 γατών που συμμετείχαν στην έρευνα προηγήθηκε η λήψη ιστορικού και η γενική κλινική εξέταση. Οι διαγνωστικές εξετάσεις (<3 ημέρες πριν την ερευνητική λαπαροτομή) για τις 57 γάτες περιελάμβαναν την παρασιτολογική εξέταση κοπράνων και την ανίχνευση αντιγόνου Giardia spp., γενική εξέταση ούρου, γενική εξέταση αίματος, προσδιορισμό βιοχημικών παραμέτρων σε ορό αίματος: λευκωματίνες (ALB), άζωτο ουρίας (BUN), κρεατινίνη (CREA), αλκαλική φωσφατάση (ALP), αλανινοαμινοτρανσφεράση (ALT), γ-γλουταμινική τρανσφεράση (γGT), ασπαραγινοαμινοτρανσφεράση (AST), ολική (TBIL), λιπάση, ιονισμένο ασβέστιο (Ca), φώσφορος (P), κάλιο (Κ), νάτριο (Na), έλεγχο της πηκτικότητας του αίματος με προσδιορισμό των χρόνων προθρομβίνης (PT) και μερικής θρομβοπλαστίνης (PTT) (52/57), προσδιορισμό της τιμής της θυροξίνης (Τ4) και της ελεύθερης θυροξίνης (Free T4), προσδιορισμό της δραστηριότητας στον ορό της ειδικής παγκρεατικής λιπάσης (fPLI με τη μέτρηση της Spec fPL®)¹⁷ (56/57) και της συγκέντρωσης της θρυψίνης και του θρυψινογόνου μέσω ανοσοαντίδρασης (fTLI) και έλεγχο των ιογενών νοσημάτων FIV, FeLV, και του κορωναιού FIP. Στις απεικονιστικές εξετάσεις περιλαμβάνονταν ακτινογραφίες θώρακος και κοιλίας, (49/57) και υπερηχογράφημα κοιλίας (56/57). Η ιστοπαθολογική διάγνωση τέθηκε μετά από λήψη ιστοτεμαχίων ολικού πάχους (τουλάχιστον 5 από κάθε γάτα: ένα από το ήπαρ, το πάγκρεας, το δωδεκαδάκτυλο, τη νήστιδα και τον ειλεό) κατά τη διάρκεια ανοιχτής λαπαροτομής και την “τυφλή” εξέτασή τους από εξειδικευμένο κτηνίατρο παθολογοανατόμο (Θ.Π.), βάση των διεθνώς αποδεκτών ιστοπαθολογικών κριτηρίων.^18-20

- Λήψη δείγματος εντερικού περιεχομένου και χολής

Πριν από τη βιοψία του εντέρου, λαμβανόταν δείγμα οπού από το δωδεκαδάκτυλο. Για τον σκοπό αυτό, εντοπιζόταν το δωδεκαδάκτυλο και με “άμελξη” σε όλο το μήκος συλλέγονταν στο μέσο του αυλού του το υγρό που υπήρχε σε αυτό. Η αναρρόφηση του οπού γινόταν με πλαστικό ενδοφλέβιο καθετήρα (Abbocath-T I.V. Catheter 20 G x 1,25», Venisystems^TM, Abbott, Ireland) προσαρμοσμένο σε σύριγγα 20 ml.¹⁵ Το δείγμα του δωδεκαδακτυλικού οπού μεταγγιζόταν άμεσα σε αποστειρωμένο, κενού αέρος, χωρίς αντιπηκτικό, γυάλινο φιαλίδιο συλλογής αίματος.

Κατά τη διάρκεια της ανοιχτής λαπαροτομής λαμβάνονταν δείγμα χολής από τη χοληδόχο κύστη σε ποσότητα 1 ml, με τη χρήση αποστειρωμένης σύριγγας 1 ml και βελόνας διαμέτρου 25 G. Σε περιπτώσεις αδυναμίας αναρρόφησης της χολής (π.χ. αυξημένο ιξώδες) χρησιμοποιούνταν βελόνα μεγαλύτερης διαμέτρου (23-21 G). Τα δείγματα μεταγγίζονταν άμεσα σε γυάλινο, αποστειρωμένο, κενού αέρος, χωρίς αντιπηκτικό φιαλίδιο συλλογής αίματος (Venoject®, Terumo Europe N.V., Leuven, Belgium).

Τα φιαλίδια χολής και εντερικού οπού τοποθετούνταν άμεσα σε ψυγείο μεταφοράς (θερμοκρασία 4-6 °C) και μέσα σε 1 ώρα από τη δειγματοληψία μεταφέρονταν στο μικροβιολογικό εργαστήριο, όπου ενοφθαλμίζονταν σε κατάλληλα θρεπτικά υποστρώματα υπό ειδικές αερόβιες, μικροαερόφιλες και αναερόβιες συνθήκες, με στόχο την ανάπτυξη των βακτηρίων που περιείχαν.

- Καλλιέργεια οπού δωδεκαδακτύλου και χολής

Απομόνωση και καταμέτρηση των βακτηρίων

Για την απομόνωση και καταμέτρηση των βακτηρίων όπως και την ταυτοποίησή τους ακολουθήθηκαν κλασικές μικροβιολογικές μέθοδοι.²¹ Για την απομόνωση αερόβιων και προαιρετικά αναερόβιων βακτηρίων, όπως των Enterobacteriaceae spp., Lactobacillus spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp. καιPseudomonas spp., χρησιμοποιήθηκαν τα υποστρώματα Blood Agar, MacConkey Agar, Rogosa Agar και Bile Esculin Agar. Για την απομόνωση αναερόβιων βακτηρίων, όπως των Clostridium spp., Bacteroides spp., Peptostreptococcus spp. και Eubacterium spp., χρησιμοποιήθηκαν τα υποστρώματα: Anaerobic Agar acc. to Brewer και TSC-Agar (Tryptose Sulfite Cycloserine Agar, Perfringens Agar). Για την απομόνωση μικροαερόφιλων βακτηριακών στελεχών, όπως εκείνων των Campylobacter spp., χρησιμοποιήθηκε το ειδικό υπόστρωμα Campylobacter Selective Agar.

Για την εκτίμηση του βακτηριακού πληθυσμού των δειγμάτων ακολουθήθηκε η τεχνική των διαδοχικών υποδεκαπλάσιων αραιώσεων αυτών (10^-1 έως 10^-6) και ο ενοφθαλμισμός της κάθε αραίωσης σε τρυβλία με την τεχνική της επιφανειακής επίστρωσης (spread plate method). Από την κάθε αραίωση ενοφθαλμίζονταν συνήθως δύο τρυβλία για κάθε θρεπτικό υπόστρωμα. Τα τρυβλία επωάζονταν στους 37°C σε αερόβιες, αναερόβιες και μικροαερόφιλες συνθήκες, ανάλογα με το υπόστρωμα που ενοφθαλμιζόταν. Για την επώαση σε αναερόβιες συνθήκες χρησιμοποιήθηκαν ειδικοί για το σκοπό αυτό περιέκτες (GasPakTM EZ Anaerobe Pouch System, Anaerobe Gas Generating pouch system with indicator, Becton Dickinson, NJ, USA), όπως και για την επώαση μικροαερόφιλων βακτηρίων (GasPakTM Campy Pouch System, BBLTM Microaerophilic Campy pouch system, Becton Dickinson, NJ, USA). Τα τρυβλία υποστρωμάτων ελέγχονταν καθημερινά για την παρουσία βακτηριακής ανάπτυξης μέχρι 48 ώρες για τις αερόβιες καλλιέργειες και μέχρι 6 ημέρες για τις αναερόβιες και μικροαερόφιλες καλλιέργειες.

Για τον υπολογισμό του πληθυσμού των βακτηρίων γινόταν καταμέτρηση των αποικιών αυτών που αναπτύχθηκαν σε αερόβιες, αναερόβιες και μικροαερόφιλες συνθήκες λαμβάνοντας υπόψη τα τρυβλία που περιείχαν 30-300 αποικίες. Απαριθμούνταν το σύνολο των ορατών αποικιών και των δύο τρυβλίων που είχαν ενοφθαλμιστεί από κάθε αραίωση και υπολογιζόταν ο μέσος όρος των δύο τρυβλίων. Ο αριθμός των βακτηρίων ικανών να σχηματίσουν αποικίες, εκφραζόταν τελικά ανά 1 ml αρχικού δείγματος (colony forming units, cfu/ml).

Ταυτοποίηση των βακτηρίων

Για την ταυτοποίηση των βακτηριακών στελεχών εκτιμήθηκαν τα εξής: (1) η ανάπτυξη στα ειδικά υποστρώματα απομόνωσης-ταυτοποίησης βακτηρίων [(i) Bile Esculin agar (BBLTM Bile Esculin Agar, Becton Dickinson, Maryland, USA): για την απομόνωση των Enterococcus spp. και τη διάκρισή τους από τα Streptococcus spp. (ii) Campylobacter Selective agar: για την απομόνωση των Campylobacter spp. (iii) TSC agar: για την απομόνωση των Clostridium spp. (iv) Rogosa agar: για την απομόνωση Lactobacilli (v) Anaerobic agar acc. to Brewer: για την απομόνωση Clostridium spp. και άλλων αναερόβιων ή μικροαερόφιλων βακτηρίων.] (2) τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των βακτηρίων μετά από χρώση (Gram stain). (3) τα αρχικά βιοχημικά χαρακτηριστικά: δοκιμή καταλάσης, δοκιμή οξειδάσης, ανάπτυξη ή όχι σε MacConkey άγαρ, δοκιμή ινδόλης, αναγωγή των νιτρικών αλάτων, παραγωγή λεκιθινάσης, παραγωγή λιπάσης. (4) η ευαισθησία ή όχι στο αντιμικροβιακό βανκομυκίνη, ως επιπρόσθετη μέθοδος πέρα από την Gram χρώση, για το διαχωρισμό μεταξύ Gram θετικών και Gram αρνητικών βακτηρίων. (5) για την περαιτέρω ταυτοποίηση των Enterobacteriaceae spp. χρησιμοποιήθηκε το σύστημα API 20 E (API® bioMérieux Inc., Durham NC, USA).

> Στατιστική ανάλυση

Με βάση την ιστοπαθολογική τους διάγνωση, οι γάτες της μελέτης χωρίστηκαν σε ομάδες. Αφού έγινε επεξεργασία των δεδομένων ακολούθησαν συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων. Οι γάτες με παγκρεατίτιδα μόνο, με ΦΝΕ σε συνδυασμό με παγκρεατίτιδα και οι γάτες με εντερικό λέμφωμα δεν συμπεριλήφθηκαν σε περαιτέρω στατιστικούς ελέγχους, λόγω του μικρού μεγέθους δείγματος σε αυτές. Για τη συνοπτική παρουσίαση των στατιστικών αποτελεσμάτων υπολογίστηκαν απόλυτες και σχετικές συχνότητες (ποσοστά %), δείκτες κεντρικής τάσης (μέσοι όροι, διάμεσες τιμές) και δείκτες διασποράς-διακύμανσης [(ελάχιστες (min)-μέγιστες (max) τιμές και τυπικές αποκλίσεις]. Για τις συγκρίσεις μέσων όρων και διάμεσων τιμών εφαρμόστηκαν οι έλεγχοι Kruskal-Wallis και Mann-Whitney. Για τις συγκρίσεις αναλογιών (ποσοστών %) χρησιμοποιήθηκε ο έλεγχος z (z-test με διόρθωση Bonferroni στο επίπεδο σημαντικότητας). Σε όλους τους στατιστικούς ελέγχους η παρατηρούμενη στάθμη σημαντικότητας (P-value) υπολογίστηκε, κατά περίπτωση, είτε με την Ακριβή Μέθοδο (Exact Method), είτε με τη μέθοδο προσομοίωσης Monte-Carlo βασισμένη σε 10.000 κύκλους επαναδειγματοληψίας.²² Το επίπεδο σημαντικότητας των στατιστικών ελέγχων προκαθορίστηκε σε α=0,05 (P≤0,05). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το στατιστικό πακέτο IBM SPSS v. 20.0 (USA, Chicago: Illinois) με εγκατεστημένο το υποσύστημα Exact Tests (Statistical pack IBM SPSS v.20.0).

> Αποτελέσματα

Βακτηριακός πληθυσμός οπού δωδεκαδακτύλου

Τα αερόβια και αναερόβια είδη των βακτηρίων που απομονώθηκαν κατά την καλλιέργεια του οπού δωδεκαδακτύλου των γατών των ομάδων, περιγράφονται στους Πίνακες 2 και 3. Σε καμία από τις καλλιέργειες οπού των γατών της έρευνας δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη μικροαερόφιλων βακτηρίων του γένους Campylobacter spp..

* προαιρετικά αναερόβια είδη βακτηρίων
Μ: μάρτυρες (n=8)
Χ: γάτες με ευρήματα χολαγγειίτιδας (n=5)
ΦΝΕ: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου (n=10)
ΦΝΕ+Χ: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου και χολαγγειίτιδας (n=14)
ΦΝΕ+Χ+Π: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου, χολαγγειίτιδας και παγκρεατίτιδας (n=6)
Π: γάτες με ευρήματα παγκρεατίτιδας (n=1)
ΦΝΕ+Π: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου και παγκρεατίτιδας (n=1)
Λ: γάτες με λέμφωμα του λεπτού εντέρου (n=3)

Μ: μάρτυρες (n=8)
Χ: γάτες με ευρήματα χολαγγειίτιδας (n=5)
ΦΝΕ: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου (n=10)
ΦΝΕ+Χ: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου και χολαγγειίτιδας (n=14)
ΦΝΕ+Χ+Π: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου, χολαγγειίτιδας και παγκρεατίτιδας (n=6)
Π: γάτες με ευρήματα παγκρεατίτιδας (n=1)
ΦΝΕ+Π: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου και παγκρεατίτιδας (n=1)
Λ: γάτες με λέμφωμα του λεπτού εντέρου (n=3)

Η ποσοτική εκτίμηση του συνόλου των αερόβιων, των αναερόβιων, καθώς και του συνολικού πληθυσμού των βακτηρίων των καλλιεργειών δωδεκαδακτυλικού οπού των γατών της έρευνας παρουσιάζονται ανά ομάδα στον Πίνακα 4.

1 αερόβια και προαιρετικά αναερόβια είδη βακτηρίων 2 αυστηρά αναερόβια είδη βακτηρίων Μ: μάρτυρες (n=8) Χ: γάτες με ευρήματα χολαγγειίτιδας (n=5) ΦΝΕ: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου (n=10) ΦΝΕ+Χ: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου και χολαγγειίτιδας (n=14) ΦΝΕ+Χ+Π: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου, χολαγγειίτιδας και παγκρεατίτιδας (n=6) Π: γάτες με ευρήματα παγκρεατίτιδας (n=1) ΦΝΕ+Π: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου και παγκρεατίτιδας (n=1) Λ: γάτες με λέμφωμα του λεπτού εντέρου (n=3)

 

Η σύγκριση του βακτηριακού πληθυσμού του δωδεκαδακτύλου των υπό διερεύνηση ομάδων γατών ως προς την ανάπτυξη αερόβιων (P=0,831), αναερόβιων (P=0,406) και του συνολικού πληθυσμού βακτηρίων (P=0,752) δεν ανέδειξε στατιστικώς σημαντικές διαφορές.

Η ποσοτική εκτίμηση των συχνότερων αερόβιων και αναερόβιων ειδών βακτηρίων που αναπτύχθηκαν στις καλλιέργειες δωδεκαδακτυλικού οπού των γατών της έρευνας παρουσιάζεται ανά ομάδα στον Πίνακα 5.

Μ: μάρτυρες (n=8)
Χ: γάτες με ευρήματα χολαγγειίτιδας (n=5)
ΦΝΕ: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου (n=10)
ΦΝΕ+Χ: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου και χολαγγειίτιδας (n=14)
ΦΝΕ+Χ+Π: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου, χολαγγειίτιδας και παγκρεατίτιδας (n=6)
Π: γάτες με ευρήματα παγκρεατίτιδας (n=1)
ΦΝΕ+Π: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου και παγκρεατίτιδας (n=1)
Λ: γάτες με λέμφωμα του λεπτού εντέρου (n=3)

Η σύγκριση του βακτηριακού πληθυσμού του δωδεκαδακτύλου των υπό διερεύνηση ομάδων γατών, ως προς την ανάπτυξη της Εscherichia coli, που εκτιμήθηκε σε αερόβιες (P=0,317) αλλά και σε αναερόβιες συνθήκες (P=0,313), καθώς και των Staphylococcus spp., τόσο σε αερόβιες (P=0,332) όσο και σε αναερόβιες συνθήκες (P=0,279), δεν ανέδειξε στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων. Στατιστικώς σημαντικές διαφορές στη σύγκριση των αποτελεσμάτων μεταξύ των ομάδων αναδείχτηκαν ως προς την ανάπτυξη των αναερόβιων Clostridium spp., όπως παρουσιάζονται στον Πίνακα 6.

Παρουσία βακτηρίων στη χολή

Η καλλιέργεια της χολής βρέθηκε αρνητική στην ανάπτυξη βακτηρίων σε όλες τις γάτες της ομάδας των μαρτύρων. Από τις ομάδες των γατών με παθολογικά ευρήματα, θετική βρέθηκε μόνο μία καλλιέργεια χολής από την ομάδα ΦΝΕ+Π, στην οποία αναπτύχθηκε το βακτήριο Enterobacter cloacae. (Πίνακας 7).

Μ: μάρτυρες (n=8)
Χ: γάτες με ευρήματα χολαγγειίτιδας (n=6)
ΦΝΕ: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου (n=13)
ΦΝΕ+Χ: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου και χολαγγειίτιδας (n=15)
ΦΝΕ+Χ+Π: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου, χολαγγειίτιδας και παγκρεατίτιδας (n=8)
Π: γάτες με ευρήματα παγκρεατίτιδας (n=1)
ΦΝΕ+Π: γάτες με ευρήματα χρόνιας φλεγμονώδους νόσου του εντέρου και παγκρεατίτιδας (n=2)
Λ: γάτες με λέμφωμα του λεπτού εντέρου (n=4)

> Συζήτηση

Στην έρευνά μας παρατηρήθηκε μεγάλη διακύμανση στους πληθυσμούς των βακτηρίων του δωδεκαδακτύλου των γατών όλων των ομάδων. Ωστόσο, κατά τη σύγκριση μεταξύ των ομάδων δεν διαπιστώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές, τόσο στον συνολικό πληθυσμό των βακτηρίων, όσο και στα υποσύνολα των αερόβιων και αναερόβιων βακτηρίων του δωδεκαδακτύλου ανάμεσα στις φυσιολογικές (ομάδα Μ) και στις γάτες με παθολογικά ευρήματα όλων των ομάδων (ΦΝΕ, Χ, ΦΝΕ+Χ, ΦΝΕ+Χ+Π, Πίνακες 4, 5 & 6). Εξετάζοντας τα αποτελέσματά μας και σε σχέση με τις βιβλιογραφικές αναφορές στη φυσιολογική χλωρίδα της γάτας, δεν διαπιστώνεται παρουσία εντερικής βακτηριακής υπερανάπτυξης στις γάτες της έρευνάς μας. Στην ομάδα των μαρτύρων της έρευνάς μας ο πληθυσμός των βακτηρίων του δωδεκαδακτύλου κυμάνθηκε από 0 έως 3,7x10³ cfu/ml (μ.ο. 9x10²). Από τις ομάδες των ασθενών γατών, οι μεγαλύτεροι πληθυσμοί βακτηρίων παρατηρήθηκαν στην ομάδα με την τριαδίτιδα (ΦΝΕ+Χ+Π, Πίνακας 4), όπου το εύρος τιμών κυμάνθηκε από 0 έως 7,6x10⁵ cfu/ml (μ.ο. 1,2x10⁵).

Τόσο οι μέσοι όροι, όσο και οι μέγιστες τιμές των βακτηρίων που παρατηρήθηκαν σε όλες τις ομάδες, ήταν εντός του εύρους τιμών που έχουν περιγραφεί στη φυσιολογική χλωρίδα της γάτας (10⁵-10⁸ cfu/ ml).^2,14,15 Ωστόσο, στην έρευνά μας διαπιστώθηκε αυξημένη παρουσία των αναερόβιων ειδών του γένους Clostridium στις γάτες της ομάδας της τριαδίτιδας (ΦΝΕ+Χ+Π, Πίνακας 5) σε σχέση με τις υπόλοιπες ομάδες των γατών. Τα Clostridium spp. (φύλο Firmicutes, οικογένεια Clostridiaceae, με τουλάχιστον 70 διαφορετικά είδη) απαρτίζουν κυρίως τη χλωρίδα του κόλου, ωστόσο απαντούν και σε άλλα τμήματα του εντέρου επιτελώντας διαφορετικές λειτουργίες.⁵ Αν και αναερόβια, λοιπόν, αποτελούν μέρος της χλωρίδας του λεπτού εντέρου της υγιούς γάτας.^2,15

Η αιτιοπαθογενετική σχέση μεταξύ των διαταραχών της χλωρίδας και πρόκλησης φλεγμονής δεν έχει αποσαφηνιστεί.¹ Ως συχνές διαταραχές έχουν αναφερθεί η αύξηση πολλών βακτηριακών ειδών που ανήκουν στα Proteobacteria, όπως η Escherichia coli, και η ελάττωση των Firmicutes και ιδιαίτερα της ποικιλότητας ορισμένων Clostridium spp..^1,10-13 Σε σκύλους με ΦΝΕ έχει παρατηρηθεί μείωση της ποικιλότητας των βακτηρίων της χλωρίδας του λεπτού εντέρου.²³ Έρευνα σε γάτες με ΦΝΕ απέδειξε την ύπαρξη «εντερικής δυσβίωσης» στις ασθενείς γάτες, με τα Enterobacteriaceae spp., Clostridium spp., Bacteroides spp. και Streptococcus spp. να αντιστοιχούν στο 91% των προσκολλημένων στον εντερικό βλεννογόνο βακτηρίων και την Εscherichia coli να αντιστοιχεί στο 30% των Enterobacteriaceae spp..⁸ Άλλη έρευνα έδειξε την επικράτηση ειδών του γένους Desulfovibrio στη χλωρίδα γατών με ΦΝΕ, ενώ είδη των γενών Bifidobacterium και Bacteroides επικρατούσαν στο βακτηριακό πληθυσμό των υγιών γατών.⁷ Στη δική μας έρευνα εν πρώτοις, φαίνεται παράδοξο το γεγονός ότι ενώ στις γάτες της ομάδας τριαδίτιδας (ΦΝΕ+Χ+Π, Πίνακας 5) βρέθηκε αυξημένος πληθυσμός Clostridium spp. στο δωδεκαδάκτυλο, στις άλλες ομάδες δεν παρατηρήθηκε κάτι ανάλογο. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει την πολυπλοκότητα της αιτιοπαθογενετικής σχέσης μεταξύ των τριών νοσολογικών καταστάσεων, αλλά και την “τοποθέτηση” της συνύπαρξής τους εξελικτικά σε πιο προχωρημένα στάδια σε σχέση με τους συνδυασμούς τους ανά δύο. Ευαίσθητες μοριακές μέθοδοι είναι δυνατό να δώσουν, στο μέλλον, απαντήσεις σχετικά με τον αυξημένο αριθμό των Clostridium spp. που διαπιστώθηκε στη δική μας μελέτη, και την πιθανή ποικιλότητα και συμβολή τους στην αιτιοπαθογένεια της τριαδίτιδας.

Σε ότι αφορά στη μικροβιολογική εξέταση της χολής, σε επίπεδα διάγνωσης περιπτώσεων χολαγγειίτιδας, αυτή συνήθως περιλαμβάνει καλλιέργεια σε αερόβιες και αναερόβιες συνθήκες καθώς και αντιβιόγραμμα για την ανάδειξη του κατάλληλου θεραπευτικού σχήματος.^24-27 Η καλλιέργεια της χολής συγκριτικά με την καλλιέργεια βιοψιών ηπατικού ιστού ή τοιχώματος της χοληδόχου κύστης, υπερτερεί ως προς την πιθανότητα ανάπτυξης μικροοργανισμών.²⁸ Παρά την επικρατούσα άποψη ότι η χολή στις υγιείς γάτες είναι στείρα,^25,29 κάποιοι ερευνητές υποστηρίζουν ότι μετακίνηση βακτηρίων από το δωδεκαδάκτυλο προς τη χολή μπορεί να συμβαίνει και σε υγιείς γάτες.²⁸ Στη δική μας έρευνα ωστόσο, δεν διαπιστώθηκε ανάπτυξη βακτηρίων στην καλλιέργεια της χολής στους υγιείς μάρτυρες.

Σε ό,τι αφορά στα είδη της χολαγγειίτιδας στη γάτα, στην οξεία ουδετεροφιλική χολαγγειίτιδα, η απομόνωση από τη χολή κυρίως Enterobacteriaceae spp. της χλωρίδας του δωδεκαδακτύλου, είναι συχνή και επιβεβαιώνει τη διάγνωση.^{24,25,28,30-35} Η μετακίνηση βακτηρίων από τον εντερικό σωλήνα στη χοληδόχο κύστη μπορεί να γίνει είτε με την παλινδρόμηση χολής από το δωδεκαδάκτυλο, είτε μέσω της αιματικής ή λεμφικής κυκλοφορίας.²⁵ Υποστηρίζεται ότι η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου και η παγκρεατίτιδα προδιαθέτουν σε χολόσταση, με συνέπεια την παλινδρόμηση παγκρεατικών εκκρίσεων ή και βακτηρίων προς το ήπαρ.^32,36 Στο χρόνιο ουδετεροφιλικό τύπο της χολαγγειίτιδας, στις περισσότερες των περιπτώσεων, η καλλιέργεια της χολής είναι αρνητική. Πιστεύεται, ότι αυτό συμβαίνει i) είτε λόγω των βακτηριοστατικών ιδιοτήτων της χολής, ii) είτε διότι η αρχική εισβολή των βακτηρίων έχει περιοριστεί από το αμυντικό σύστημα του οργανισμού, iii) είτε, εξαιτίας προηγούμενης χορήγησης αντιμικροβιακών, και iv) στις περιπτώσεις που τα βακτήρια δεν αποτελούν άμεσα την αιτία της φλεγμονώδους κατάστασης.^24,37-39 Ωστόσο, ακόμη και στις χρόνιες μη βακτηριολογικής αιτιολογίας περιπτώσεις χολαγγειίτιδας, η χρόνια διήθηση των χολαγγείων από φλεγμονώδη κύτταρα καθιστά ευάλωτο το ήπαρ σε δευτερογενείς μολύνσεις από Enterobacteriaceae spp., όπως η Εscherichia coli.²⁶

Στον λεμφοκυτταρικό τύπο της χολαγγειίτιδας φαίνεται να εμπλέκεται ένας ανοσολογικής φύσεως αιτιοπαθογενετικός μηχανισμός.^40-42 Ωστόσο, εκφράζεται και η άποψη ότι ο συγκεκριμένος τύπος χολαγγειίτιδας αντιπροσωπεύει τη χρόνια εξέλιξη της οξείας ουδετεροφιλικής χολαγγειίτιδας ή μιας ανιούσας (από το δωδεκαδάκτυλο) βακτηριακής μόλυνσης.^31,37,38 Τα δεδομένα στα οποία μπορεί να στηριχθεί η υπόθεση μιας πρωτογενούς μικροβιακής λοίμωξης είναι λίγα.⁴² Υπάρχουν δύο έρευνες που αφορούν σε μικρή ομάδα γατών με σύνδρομο χολαγγειίτιδας/χολαγγειοηπατίτιδας στις οποίες ανιχνεύτηκε DNA βακτηρίων του γένους Helicobacter, χωρίς ωστόσο να είναι ξεκάθαρη η παθοφυσιολογική σημασία του ευρήματος αυτού.^43,44 Σημειώνεται ότι μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν στοιχεία που να συσχετίζουν την παρουσία Helicobacter spp. με τη ΦΝΕ και την παγκρεατίτιδα στην γάτα.^8,45 Επίσης, σε μια πειραματική μελέτη περιγράφεται η πρόκληση μέτριας έντασης φλεγμονής στη ζώνη 1 του ήπατος γατών, μετά από μόλυνση με Bartonella spp..⁴⁶ Παρότι οι ενδείξεις εμπλοκής ενός ανοσολογικού μηχανισμού στην πρόκληση της χολαγγειίτιδας είναι αρκετές, η αιτιοπαθογένεια της νόσου παραμένει αινιγματική.⁴²

Τα αποτελέσματα της δικής μας έρευνας δεν συμφωνούν με την υπόθεση της πρωτογενούς μικροβιακής λοίμωξης, μιας και στο σύνολό τους τα δείγματα χολής των γατών με χολαγγειίτιδα βρέθηκαν στείρα βακτηρίων. Από τις γάτες χωρίς ευρήματα χολαγγειίτιδας, ένα μόνο δείγμα χολής βρέθηκε θετικό με ανάπτυξη του βακτηρίου Εnterobacter cloacae. Πρόκειται για μια γάτα η οποία εμφάνιζε παγκρεατίτιδα και ΦΝΕ (Πίνακας 7, ομάδα ΦΝΕ+Π) παράλληλα με χολόσταση, χωρίς να εμφανίζει ιστοπαθολογικά ευρήματα χολαγγειίτιδας, ούτε λιπώδους εκφύλισης. Όπως προαναφέρθηκε, η χολόσταση, που στη συγκεκριμένη περίπτωση οφειλόταν στην παρεμπόδιση της παροχέτευσης της χολής λόγω της παγκρεατίτιδας, αποτέλεσε παράγοντα κινδύνου για την εισβολή προς την χοληδόχο κύστη του Εnterobacter cloacae, που αποτελεί μέλος της φυσιολογικής χλωρίδας του λεπτού εντέρου. Δυστυχώς, από τη γάτα αυτή δεν πραγματοποιήθηκε καλλιέργεια εντερικού περιεχομένου από το δωδεκαδάκτυλο και ως εκ τούτου δεν υπάρχει ακριβής εικόνα της εντερικής χλωρίδας. Αντίστοιχη υπόθεση ωστόσο, δεν μπορεί να εξηγήσει τη φλεγμονή στο χοληφόρο σύστημα που παρατηρήθηκε στις 29 γάτες με ευρήματα χολαγγειίτιδας της μελέτης μας, στις οποίες οι καλλιέργειες της χολής βρέθηκαν αρνητικές. Η δυνατότητα μετακίνησης βακτηρίων προς το ήπαρ και κατά συνέπεια και το πάγκρεας, μέσω του κοινού χοληδόχου και παγκρεατικού πόρου, δεν αποκλείει το σενάριο ανοσολογικής αντίδρασης του οργανισμού σε παρόμοιες μικροβιακές εισβολές.

Ανακεφαλαιώνοντας, η παρούσα έρευνα έδειξε ότι τα φλεγμονώδη νοσήματα του γαστρεντερικού που συνδέονται με την τριαδίτιδα καθώς και το εντερικό λέμφωμα, δεν σχετίζονται σε ότι αφορά στην αιτιοπαθογένειά τους με το βακτηριακό πληθυσμό της χλωρίδας του δωδεκαδακτύλου ή με πιθανή παρουσία βακτηρίων στη χολή. Το έντερο και το ήπαρ παίζουν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στην ανοσολογία του οργανισμού. Το πολύπλοκο σύστημα της εντερικής χλωρίδας, επηρεάζει πολλές λειτουργίες όπως και τη συνολική υγεία του οργανισμού και κάθε διαταραχή στην αλληλεπίδρασή του με τον τοπικό ανοσολογικό μηχανισμό του εντέρου θα μπορούσε να οδηγεί σε γαστρεντερική νόσο.^1,6-10 Εν κατακλείδι, ένας ανοσολογικός μηχανισμός μπορεί να εμπλέκεται πίσω από την εμφάνιση της τριαδίτιδας στη γάτα.^42,47 Η χρήση σύγχρονων μοριακών μεθόδων ανάλυσης στη διερεύνηση της συσχέτισης των βακτηρίων της εντερικής χλωρίδας και της ποικιλότητας αυτών με τις ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις του εντέρου, του ήπατος και του παγκρέατος προβλέπεται να δώσει επιπλέον απαντήσεις.

> Βιβλιογραφία

1. Suchodolski JS. Companion Animals Symposium: Microbes and gastrointestinal health of dogs and cats. J Anim Sci 2011, 89: 1520-1530.

2. Johnston K, Lamport A, Batt RM. An Unexpected Bacterial- Flora in the Proximal Small-Intestine of normal cats. Vet Rec 1993, 132: 362-363.

3. Sparkes AH, Papasouliotis K, Sunvold G, Werrett G, Clarke C, Jones M, Gruffydd-Jones TJ, Reinhart G. Bacterial flora in the duodenum of healthy cats, and effect of dietary supplementation with fructo-oligosaccharides. Am J Vet Res 1998, 59: 431-435.

4. Johnston KL, Swift NC, Forster-van Hijfte M, Rutgers HC, Lamport A, Ballevre O, Batt. RM. Comparisοn of the bacterial flora of the duodenum in healthy cats and cats with signs of gastrointestinal tract disease. J Am Vet Med Assoc 2001, 218: 48–51.

5. Suchodolski JS. Gastrointestinal Microbiota. In: Canine and Feline Gastroenterology. Washabau RJ and Day MJ (eds). Elsevier Saunders: Missouri, 2013, pp. 32-41.

6. German AJ, Day MJ, Ruaux CG, Steiner JM, Williams DA, Hall EJ. Comparison of direct and indirect tests for small intestinal bacterial overgrowth and antibiotic-responsive diarrhea in dogs. J Vet Intern Med 2003, 17: 33-43.

7. Inness VL, McCartney AL, Khoo C, Gross KL, Gibson GR. Molecular characterisation of the gut microflora of healthy and inflammatory bowel disease cats using fluorescence in situ hybridisation with special reference to Desulfovibrio spp. J Anim Physiol Anim Nutr (Berl) 2007, 91: 48-53.

8. Janeczko S, Atwater D, Bogel E, Greiter-Wilke A, Gerold A, Baumgart M, Bender H, McDonough PL, McDonough SP, Goldstein RE, Simpson KW. The relationship of mucosal bacteria to duodenal histopathology, cytokine mRNA, and clinical disease activity in cats with inflammatory bowel disease. Vet Microbiol 2008, 128: 178-193.

9. Xenoulis PG, Palculict B, Allenspach K, Steiner JM, Van House AM, Suchodolski JS. Molecular-phylogenetic characterization of microbial communities imbalances in the small intestine of dogs with inflammatory bowel disease. FEMS Microbiol Ecol 2008, 66: 579-589.

10. Packey CD, Sartor RB. Commensal bacteria, traditional and opportunistic pathogens, dysbiosis and bacterial killing in inflammatory bowel diseases. Curr Opin Infect Dis 2009, 22: 292-301.

11. Craven M, Dogan B, Schukken A, Volkman M, Chandler A, McDonough PL, Simpson KW. Antimicrobial resistance impacts clinical outcome of granulomatous colitis in boxer dogs. J Vet Intern Med 2010, 24: 819-824.

12. Suchodolski, JS, Xenoulis PG, Paddock CG, Steiner JM, Jergens AE. Molecular analysis of the bacterial microbiota in duodenal biopsies from dogs with idiopathic inflammatory bowel disease. Vet Microbiol 2010, 142: 394-400.

13. Suchodolski JS, Dowd SE, Wilke V, Steiner JM, Jergens AE. 16S rRNA Gene Pyrosequencing Reveals Bacterial Dysbiosis in the Duodenum of Dogs with Idiopathic Inflammatory Bowel Disease. Plos One 2012, 7:e39333. doi: 10.1371/journal.pone.0039333.

14. Johnston KL. Small intestinal bacterial overgrowth. Vet Clin North Am Small Anim Pract 1999, 29: 523-550.

15. Johnston KL, Lamport A, Ballevre O, Batt RM. A comparison of endoscopic and surgical collection procedures for the analysis of the bacterial flora in duodenal fluid from cats. Vet J 1999, 157: 85-89.

16. Fragkou FC, Adamama-Moraitou KK, Poutahidis T, Prassinos NN, Kritsepi-Konstantinou M, Xenoulis PG, Steiner JM, Lidbury JA, Suchodolski JS, Rallis TS. Prevalence and Clinicopathological Features of Triaditis in a Prospective Case Series of Symptomatic and Asymptomatic Cats. J Vet Intern Med 2016, 30: 1031-1045.

17. Xenoulis PG, Steiner JM. Canine and feline pancreatic lipase immunoreactivity. Vet Clin Pathol 2012, 41: 312–324.

18. Van den Ingh TS, Cullen JM, Twedt DC, Van Winkle T, Desmet VJ, Rothuizen J. Morphological classification of biliary disorders of the canine and feline liver. In: WSAVA Standards for Clinical and Histological Diagnosis of Canine and Feline Liver Diseases. Rothuizen J, Bunch SE, Charles JE, Cullen JM, Desmet VJ, Szatmari V, Twedt DC, Van den Ingh TS, Van Winkle T, Washabau RJ (eds). Elsevier: Philadelphia, 2006, pp. 68-71.

19. De Cock HEV, Forman MA, Farver TB, Marks SL. Prevalence and histopathologic characteristics of pancreatitis in cats. Vet Pathol 2007, 44: 39-49.

20. Washabau RJ, Day MJ, Willard MD, Hall EJ, Jergens AE, Mansell J, Minami T, Bilzer TW. Endoscopic, biopsy, and histopathologic guidelines for the evaluation of gastrointestinal inflammation in companion animals. J Vet Intern Med 2010, 24: 10-26.

21. Quinn PT, Carter ME, Markey BQ, Carter GR. Clinical Veterinary Microbiology. Mosby, 1999.

22. Mehta CR, Patel NR. Exact logistic regression: theory and examples. Stat Med 1995, 14: 2143-2160.

23. Xenoulis PG, Palculict B, Allenspach K, Steiner JM, Van House AM, Suchodolski JS. Molecular-phylogenetic characterization of microbial communities imbalances in the small intestine of dogs with inflammatory bowel disease. FEMS Microbiology Ecology 2008, 66: 579-589.

24. Hirsch VM, Doige CE. Suppurative cholangitis in cats. J Am Vet Med Assoc 1983, 182: 1223-1226.

25. Brain PH, Barrs VR, Martin P, Baral R, White JD, Beatty JA. Feline cholecystitis and acute neutrophilic cholangitis: clinical findings, bacterial isolates and response to treatment in six cases. J Feline Med Surg 2006, 8: 91.

26. Rothuizen J. Liver-Diseases of the biliary system in cats. In: Small Animal Gastroenterology. Steiner JM (ed). Schlütersche: Hannover, 2008, pp. 275-278.

27. Harvey AM, Gruffydd-Jones TJ. Feline Inflammatory Liver Disease In: Textbook of Veterinary Internal Medicine: diseases of the dog and cat. Ettinger SJ and Feldman EC (eds). 7th edn. Saunders, Elsevier: St Louis, 2010, pp. 1643-1709.

28. Wagner KA, Hartmann FA, Trepanier LA. Bacterial culture results from liver, gallbladder or bile in 248 dogs and cats evaluated for hepatobiliary disease: 1998-2003. J Vet Intern Med 2007, 21: 417-424.

29. Savary-Bataille KCM, Bunch SE, Spaulding KA, Jackson MW, Law JM, Stebbins ME. Percutaneous ultrasound guided cholecystocentesis in healthy cats. J Vet Intern Med 2003, 17: 298.

30. Kaufman AC. Infectious causes of feline hepatobiliary disease. Vet Med 1994, 89: 869-873.

31. Day DG. Feline cholangiohepatitis complex. Vet Clin North Am Small Anim Pract 1995, 25: 375-385.

32. Center SA. Diseases of the gall bladder and biliary tree. In: Small Animal Gastroenterology. Guilford WG, Center SA, Strombeck DR, Williams DA, MeyerDJ (eds). 3rd edn. Saunders: Philadelphia, 1996, pp. 860-888.

33. Center SA. Hepatobiliary infections. In: Infectious Diseases of the Dog and Cat. Greene CE (ed). 2nd edn. WB Saunders: Philadelphia, 1998, pp. 615-625.

34. Lapointe JM, Higgins R, Barrette N, Milette S. Enterococcus hirae enteropathy with ascending cholangitis and pancreatitis in a kitten. Vet Pathol 2000, 37: 282-284.

35. Mayhew PD, Holt DE, McLear RC, Washabau RJ. Pathogenesis and outcome of extrahepatic biliary obstruction in cats. J Small Anim Pract 2002, 43: 247-253.

36. Weiss DJ, Armstrong PJ, Gagne J. Inflammatory liver disease. Semin Vet Med Surg (Small Anim) 1997, 12: 22-27.

37. Zawie DA, Garvey MS. Feline hepatic disease. Vet Clin North Am Small Anim Pract 1984, 14: 1201.

38. enter SA, Rowland PH. The cholangitis/cholangiohepatitis complex in the cat. In: Congress Proceedings of ACVIM Forum. San Francisco, 1994, pp. 766-771.

39. Ράλλης ΤΣ. Νοσήματα του ήπατος. Στο: Γαστρεντερολογία του Σκύλου και της Γάτας. Ράλλης ΤΣ (ed). 2η έκδοση, University Studio Press: Θεσσαλονίκη, 2006, pp. 227-310.

40. Prasse KW, Mahaffey EA, De Novo R, Cornelius L. Chronic lymphocytic cholangitis in three cats. Vet Pathol 1982, 19: 99-108.

41. Day MJ. Immunohistochemical characterization of the lesions of feline progressive lymphocytic cholangitis/cholangiohepatitis. J Comp Pathol 1998, 119: 135-147.

42. Warren Α, Center S, McDonough S, Chiotti R, Goldstein R, Meseck E, Jacobsen M, Rowland P, Simpson K. Histopathologic features, Immunophenotyping, Clonality, and Eubacterial Fluorescence In Situ Hybridization in Cats with Lymphocytic Cholangitis/ Cholangiohepatitis. Vet Pathol 2011, 48: 627-641.

43. Boomkens SY, Kusters JG, Hoffmann G, Pot RG, Spee B, Penning LC, Egberiink HF, van den Ingh TS, Rothuizen J. Detection of Helicobacter pylori in bile of cats. FEMS Immunol Med Microbiol 2004, 42: 307-311.

44. Greiter-Wilke A, Scanziani E, Soldati S, McDonough SP, Mc- Donough PL, Center SA, Rishniw M, Simpson KW. Association of Helicobacter with cholangiohepatitis in cats. J Vet Intern Med 2006, 20: 822-827.

45. Simpson KW. Is there a direct link between IBD, Cholangitis, and Pancreatitis in cats? (abstract). In: Congress Proceedings of ECVIM-CA. Maastricht, The Netherlands, 2012, pp. 169-171.

46. Kordick DL, Brown TT, Shin K, Breitschwerdt EB. Clinical and pathologic evaluation of chronic Bartonella henselae or Bartonella clarridgeiae infection in cats. J Clin Microbiol 1999, 37: 1536-1547.

47. Simpson KW. Pancreatitis and triaditis in cats: causes and treatment. J Small Anim Pract 2015, 56: 40-49.